Eine einheitliche Definition, was unter einer Non-Profit-Organisation zu verstehen ist, gibt es nicht. Grundsätzlich existieren sowohl Negativ- als auch Positivdefinitionen des Begriffs. Naheliegend ist vor allem eine Definition ex negativo, da der Begriff selbst Non-Profit-Organisationen von Unternehmen, die eine Gewinnerzielungsabsicht verfolgen (Profit-Unternehmungen), abgrenzt. Voraussetzung, um eine solche Abgrenzung von Profit- und Non-Profit-Organisationen überhaupt vornehmen zu können, ist ihr gemeinsames Bestehen in einem kapitalistischen System.
Orientiert man sich an dieser sehr breitgefassten Definition, dann zählen sowohl öffentliche als auch private Organisationen und Institutionen, z. B. Schulen, Gefängnisse, Parteien, Kirchen, Vereine und Museen zu den Non-Profit-Organisationen.
Die Positivdefinitionen sind meist etwas enger gefasst: Ihnen zufolge darf eine NPO nicht nur keine Gewinnabsicht verfolgen, sie muss sich darüber hinaus auch durch ein gewisses Maß an Eigenorganisation und bestimmte formelle Strukturen auszeichnen. Entscheidungen müssten in der NPO selbst – also von innen heraus – getroffen werden, ohne Beeinflussung von außen. In der Forschungsliteratur behaupten einige Autoren auch, dass eine Organisation keinerlei Überschüsse an Mitglieder auszahlen dürfe oder zumindest teilweise auf Freiwilligenarbeit basieren müsse, um den Status einer Non-Profit-Organisation zu haben.
Der Begriff NPO ist keine rechtliche Bezeichnung. Als mögliche Rechtsformen für eine Non-Profit-Organisation kommen – je nach Definition – eingetragene Vereine, Stiftungen, Genossenschaften, gemeinnützige GmbHs oder öffentlich-rechtliche Betriebe gewerblicher Art in Frage.